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国家动物模型信息平台收录EV71感染PSGL1转基因小鼠模型

2021年07月27日 来源:

  手足口病是肠道病毒引起的传染性、出疹性疾病,该病多发生于5岁以下的婴幼儿,可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡,个别手足口病患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症,而神经源性肺水肿、肺出血和心力衰竭被认为是导致死亡的主要原因。

  引发手足口病的肠道病毒有20多种,包括柯萨奇病毒A组和B组、人肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)以及疱疹病毒、腺病毒等,其中以柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16,CA16)和肠道病毒71型(EV71)最为常见。而绝大多数重症手足口病病例,均由EV71或CA16病毒感染所致。

  EV71属于微小RNA病毒科,肠道病毒属,主要通过粪口传播,病毒最初定植于鼻咽部或胃肠道粘膜,侵入淋巴组织并在其中繁殖,进而引起第一次病毒血症。若机体免疫力差,病毒可扩散至全身组织器官,大量繁殖后再次入血,引起第二次病毒血症,最终侵犯靶器官,如脑、脑膜、脊髓、心肌和横纹肌以及皮肤黏膜组织,引起重症病变,其主要病变为神经元坏死等。

  PSGL-1(P-selectin glycoprotein ligand-1)蛋白是一种糖蛋白,作为细胞粘附分子P-、E-、L-选择素的高亲和力反受体,参与了炎症反应过程中免疫细胞的迁移。同时,有研究表明PSGL-1也是人EV71病毒的受体,在体外细胞实验中表达人PSGL-1蛋白可以提高细胞对EV71的敏感性。由于目前的EV71小鼠模型采用乳鼠(14日龄以内),可用于感染研究的周期太短,且其免疫系统发育不成熟,限制了该模型在研究EV71致病机理中的应用。

  中国医学科学院医学实验动物研究所刘江宁教授课题组通过建立表达人PSGL-1的转基因小鼠,以提高小鼠对EV71病毒的敏感性,从而有望提高敏感小鼠的年龄,建立成年的EV71感染模型。

  课题组以人PSGL-1的mRNA为模板,经反转录获得人PSGL-1的cDNA,将其插入pCDNA3.1(+)载体的启动子下游,构建转基因载体。载体经测序验证正确后,将其线性化并经显微注射到C57BL/6J的受精卵中,用129做假孕受体,制备转基因小鼠。人PSGl-1转基因小鼠经RT-PCR和Western blotting鉴定,表明人PSGL-1蛋白主要在小鼠的骨骼肌和脑中表达,可检测到该基因的mRNA表达及蛋白(图1)。

  对10日龄人PSGl-1转基因小鼠腹腔注射感染EV71 病毒的小鼠适应株MP10(GenBank:HQ712020)5×106 TCID50。动物自感染后第3天开始出现症状,表现为体重增长变缓、弓背竖毛、后肢行动迟缓至瘫痪、死亡等症状。感染后第4天时,动物全部表现出后肢瘫痪、停止进食等症状,感染后第5天动物开始出现死亡,在10天内全部死亡,该特征类似于EV71重症感染小鼠模型。实时荧光定量PCR检测表明病毒主要复制部位为骨骼肌和脑,病毒在感染后第3天达到高峰,主要病理表现为坏死性肌炎。

  相对于野生型小鼠,感染后第3天,PSGL-1转基因小鼠的骨骼肌、脊髓和脑内的病毒载量显著高于野生型小鼠(图2A-C),但是在第5天时,该差别不再明显,表明表达人PSGL-1蛋白可以一过性的促进EV71小鼠适应株感染小鼠。与病毒复制相一致,第3天转基因小鼠的后肢出现双侧瘫痪,症状明显比野生型小鼠严重,但在第5天时症状类似(图2D-E)。提高病毒的感染剂量,并不能使两周以上的转基因小鼠表现出明显的症状,表明人PSGL-1具有一定的促进EV71感染效果。

 

图1. 人PSGL-1转基因小鼠鉴定.A,人PSGL-1基因设计;B,转基因小鼠基因型鉴定;C,骨骼肌和脑内人PSGL-1基因的mRNA检测;D,Western blotting检测骨骼肌和脑内人PSGL-1蛋白表达检测。

 

图2. EV71的小鼠适应株MP10感染转基因小鼠和野生型小鼠. A-C,组织内病毒载量,A(骨骼肌),B(脊髓),C(脑);D,临床症状评分的变化曲线;E,感染第3天和第5天时的小鼠状态照片。

 

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参考文献:
Jiangning Liu, Wei Dong, Xiongzhi Quan, Chunmei Ma, Chuan Qin, Lianfeng Zhang. Transgenic expression of human P-selectin glycoprotein ligand-1 is not sufficient for enterovirus 71 infection in mice. Arch Virol (2012) 157: 539-543.

 

 
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